转录组测序

转录组测序

转录组测序概述

转录组学(Transcriptomics)是一门在整体程度上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科,转录组测序(Transcriptome Sequencing)即从总RNA 中富集出单链mRNA 经反转录得到双链cDNA, 而后对其进行高通量测序分析.能够全面快速地获取某一物种特定组织在某一功效状态下所能转录出来的所有mRNA的基因序列,用于研究基因差别化表达,基因结构和基因功效、可变剪接和新转录本预测、融合基因检测等重要问题,目前,转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控和逆境胁迫适应机制、生物进化规律、疾病产生发展的重要机制以及创造致病基因调控的要害靶点等方面的最佳研究手段。

技巧路线

生物信息分析

样品恳求


Total RNA
转录组样品(真核、原核,链特异性
总RNA≥5ug,至少2次文库制备量

样品浓度和纯度
样品浓度≥100ng/ul ,OD260/280=1.8-2.0

样品德量
  • 确保RNA完整性,无降解 ,无污染
  • Agilent 2100检测
  • 28S:18S≥1
  • 23S:16S≥1
  • 动物RIN≥7
  • 植物RIN≥6.5

样品保存
DEPC水保存

样品运输
干冰低温运输,请勿重复冻融
组织样品
动物、植物、细菌、昆虫
总量≥500mg新鲜样品 (植物尽量取新鲜幼嫩部位)
采样后立即利用RNAlater处理并液氮速冻,保存于-80℃,干冰运输


测序策略


测序策略
推荐数据量
交付周期
Hi-seq PE125/150
有参:2G/4G/6G clean data
正常交付周期(工作日)
样品数
0<X<=10 50天
10<X<=50 70天
50<X<=100 90
100<X<=300 110天
备注:无参考加多10天

无参: 4G/6G/8G clean data


参考案例

柑橘转录组项目

1)方法:对柑橘3个(每个样品3x重复)样品进行HiSeq 2500, PE125bp转录组测序

2)分析流程:

本项目同时利用了Trinity和Cufflinks进行组装;Trinity重要是进行无参考基因组的组装,Cufflinks重要用于有参考基因组的组装(本项目重要用甜橙基因组和克里曼丁红橘基因组);然后分辨用3个组装成果,最终打算差别表达基因

   

图1展现了对表达量FPKM值取对数后的散布

横坐标为基因的log10(FPKM)值,纵坐标为对应log10(FPKM)的密度,不同色彩代表不同样品, 对不同样本间基因的FPKM密度散布进行比较能整体上懂得不同样本间的FPKM散布情况

2热图显示各个样本中不同基因的表达模式,

横坐标为样品号,纵坐标为基因名,色彩的深浅代表了表达量的多少,红色表现表达程度上升,绿色表现表达程度降落。差别基因聚类热图分析用于断定不同实验条件下差别基因表达量的聚类模式。

参考文献

  • Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Cole Trapnell, Brian Williams, Geo Pertea, Ali Mortazavi, Gordon Kwan, Jeltje van Baren, Steven Salzberg, Barbara Wold, LiorPachter. Nature Biotechnology, 2010, doi:10.1038/nbt.1621.
  • Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias. Adam Roberts, Cole Trapnell, Julie Donaghey, John L. Rinn, LiorPachter. Genome Biology, 2011, doi:10.1186/gb-2011-12-3-r22.
  • Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq. Cole Trapnell, David Hendrickson, Martin Sauvageau, Loyal Goff, John L. Rinn, LiorPachter Nature Biotechnology, 2012, doi:10.1038/nbt.2450.
  • Differential gene and transcript expression analysisof RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.Trapnell C, Roberts A, Goff L, Pertea G, Kim D, Kelley DR, Pimentel H, Salzberg SL, Rinn JL, PachterL.NatProtoc. 2012 Mar 1;7(3):562-78. doi: 10.1038/nprot.2012.016. Erratum in: Nat Protoc. 2014 Oct;9(10):2513.
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